Аллергия     |     Участие ацетилхолина в механизме анафилаксии и аллергии

Роль медленно реагирующей субстанции (мрс-а или srs) в патогенезе анафилаксии

Термином slowly reacting substance (SRS), или медленно реагирующая субстанция (МРС), обозначают вещество или группу веществ неизвестной химической природы, вызывающих сокращение гладких мышц, особенно изолированной кишки морской свинки. Как видно из названия, сокращение возникает медленнее, чем при воздействии гистамина или ацетилхолина, и обычно затягивается на время от момента аппликации веществ до начала сокращения.

Термин медленно реагирующая субстанция был предложен Feldberg и Kellaway в 1938 г. для вещества, полученного при перфузии легких ядом кобры. Появление МРС при обработке сенсибилизированной ткани специфическим антигеном впервые было описано Kellaway и Trethewie в 1940 г. Эту проблему вновь исследовал Brocklehurst в 1955 г. Тогда уже были синтезированы сильные и специфические антигистамииные вещества, с помощью которых можно было полностью исключить реакцию на гистамин. На сокращение, вызываемое МРС, антигистамииные препараты не оказывали влияния даже в высоких концентрациях (10-6).

Медленно реагирующая субстанция, образуемая в легких морской свинки при анафилаксии, отличается по фармакологической активности от других веществ группы SRS, поэтому ее назвали SRS-A, или МРС-А (медленно реагирующая субстанция анафилаксии). Одной из точно установленных функций МРС-А является участие ее в анафилактическом бронхоспазме при бронхиальной астме у человека (Brocklehurst, 1962).

Единица МРС-А соответствует активности инкубационной жидкости, появляющейся при действии антигена на 10 мг размельченных легких сенсибилизированной свинки (Ghakravarty, 1960).

Установлено, что МРС-А относительно устойчива в неочищенном виде (шоковый перфузат легких) и не теряет активности при рН 2,0—12,0 с наибольшей устойчивостью в щелочной среде. MPG-A достаточно устойчива к протеолитическим ферментам (трипсин, химотрипсин, пепсин, активированный папаин).

Осаждение же белков кислотой (например, трихлор-уксусной) удаляет всю МРС-А из раствора, возможно, в результате необратимой адсорбции: после этой процедуры активность МРС-А не восстанавливается. Если для осаждения белка использовать 20 объемов ацетона, то вместе с МРС осаждаются фосфолипиды и крупные пептиды. Медленно реагирующая субстанция оказывается связанной преципитатом, однако при растворении осадка в физиологическом растворе или растворе Тироде активность ее полностью восстанавливается. Это отличает МРС от гистамина, который обычно остается в осадке; МРС, свободная от гистами-на и избытка солей, отделяется путем адсорбции на активированном угле, из которого извлекается п-бутанолом.

Так как МРС легко соединяется с липидами и легко адсорбируется, мы полагаем, что в опытах на изолированных органах ее адсорбция может произойти на мембранах гладкомышечных клеток. При этом нарушается движение ионов через мембрану и возникает контрактура. Затруднением движения ионов через клеточную мембрану объясняется замедленное и продолжительное действие МРС.

Химическая природа МРС изучена мало. МРС-А, по-видимому, представляет собой соединение гликолилнейраминовой кислоты с глюкозидом. Гликолилнейраминовая кислота относится к группе сиаловых (сиалино-вых) кислот. Она представляет собой нейраминовую кислоту (схема 21), ib которой аминогруппа соединена с гликолиевой кислотой (GH2OH СOOH) через карбаминовую связь. МРС-А активна в соединении с белками и фосфолипидами плазмы человека. Активные комплексы МРС-А с белками и фосфолипидами имеют относительную молекулярную массу от 900 до 1400.

Для биологического тестирования МРС обычно используют отрезок подвздошной кишки морской свинки, обработанный атропином 5.10-7М и мепирамииом (иеоаидергаи) 10~6М.

Медленно реагирующая субстанция вызывает реакцию изолированной кишки морской свинки через некоторый латентный период (от 5 до 30 с). Сокращение медленно (около 2 мин) достигает пика, расслабление также идет медленно; МРС сенсибилизирует кишку к гистамииу подобно другим липидорастворимым кислотам.

Пороговая доза стандартной МРС для кишки морской свинки составляет 0,5—4 ЕД. Для двенадцатиперстной кишки кролика и прямой кишки крысы соответственно требуется 10 и 8 ЕД МРС. Медленно реагирующая субстанция из лапы кошки оказывает подобное же действие на гладкие мышцы. В дозах 40—20 ЕД МРС не действует на прямую кишку хомяка, слепую кишку петуха и матку крысы или морской свинки.

Медленно реагирующая субстанция в дозе 140—300 ЕД при внутривенном введении совместно с атропином и антигистаминными веществами не меняет артериального давления у кошек. Возможно, что МРС немедленно инактивируется в крови.

Uvnas с соавт. (1960) обнаружили быструю инактивацию МРС при инкубации ее с тучными клетками, если последние содержали хотя бы следы сыворотки.

Brocklehurst (1956) перфузировал и обрабатывал аллергеном кусочки легких, вырезанных при операции у больных бронхиальной астмой. Аллерген был выявлен с помощью кожных и провокационных тестов. В перфузате гистамин и МРС появлялись примерно в такие же промежутки времени, как в опытах на морских свинках. Легкие сенсибилизированной обезьяны Macacus rhesus также реагировали на аллерген освобождением МРС. В перфузате легких кролика во время анафилаксии обнаружены гистамин и МРС, но временные соотношения были несколько иными.

Многие свойства МРС идентичны таковым липидорастворимых кислот, однако она отличается по растворимости в органических растворителях от полипептидов типа брадикинина или субстанции Р, которые также оказывают слабое возбуждающее действие на кишку морской свинки (Gaddum, 1955). Некоторые активные полипептиды (простагландин и др.) отличаются от МРС своим возбуждающим действием на матку крыс и морских свинок. Простаглаидии снижает артериальное давление у кошек, что не характерно для МРС. Он отличается также от МРС и возбуждающим действием на прямую кишку хомяка. Прямая кишка крысы также более чувствительна к простагландину, чем к МРС. Медленно реагирующая субстанция не обладает гемолитическими свойствами. При повторных испытаниях чувствительность кишки к МРС не снижается в отличие от ее чувствительности к другим липидорастворимым веществам.

Brocklehurst (1962) отметил параллелизм в появлении в перфузате легких гистамина и МРС. Однако гистамии выходит в перфузат очень быстро — в течение 1—2 мин; МРС в этот период еще не определяется. После начального выхода нарастание концентраций этих веществ происходит параллельно, достигая максимума на 16—32-й минуте, после чего их уровень прогрессивно уменьшается. По-видимому, МРС освобождается из тучных клеток. Во время анафилактической реакции образование МРС происходит за счет ферментативной активности мембран тучных клеток, в то время как гистамин выходит из них в результате повышения проницаемости мембран.

На выход МРС влияют температура, рН, активность тканевых ферментов, количество антигена и т. д. Оптимальный рН для МРС составляет 8,5, т. е. примерно такой же, как для гистамипа. Ни МРС, пи гистамин не выходит при рН выше 9,5 и ниже 5,6—6,3. Оба они разрушаются при нагревании до 45°С в течение 5—10 мин; оптимум их действия проявляется при температуре 37°С. Лпоксия задерживает выход и гистамипа, и МРС. Paton (1051) обнаружил появление МРС в крови кошек и собак при введении им вещества 48/80. Изучение процессов освобождения гистамипа и МРС у кошек и морских свинок при действии антигена и вещества 48/80 дает возможность заключить, что механизмы их появления очень близки. Riley (1958) считал, что предполагаемый фермент, вызывающий освобождение МРС, мог бы быть типа лецитииазы С.

А. Д. Лдо и Л. М. Ишимова (1964) исследовали условия образования и выделения МРС~А из легких сенсибилизированных животных при действии антигена на размельченные ткани или при введении антигена в ток перфузии изолированного препарата легких.

Сенсибилизацию морских свинок проводили введением 0,2 мл лошадиной сыворотки либо 0,2 мл разведенного в 5 раз иативиого яичного белка из свежих куриных яиц. Аллергены вводили подкожно 3 раза с интервалами в один день. Животных брали в опыт на 20—36-й день после первом сенсибилизирующей инъекции.

Сенсибилизацию кроликов проводили инъекциями 1 мл сыворотки подкожно и с интервалами 5 дней 5—6 раз (до появления гиперергического воспаления). Животные поступали в опыт на 10—12-й день после последней инъекции.

Для приготовления стандартного препарата МРС-А, необходимого в работе, пользовались методом Chakravarty (1959). Этот метод состоит в следующем: 15—20 морских свинок, сенсибилизированных яичным белком или лошадиной сывороткой, на 25—30-й день сенсибилизации убивают кровопусканием. Их легкие извлекают, обмывают жидкостью Тироде и размельчают ножницами па мелкие кусочки (1—2 мм). Измельченную ткань дважды промывают теплым раствором Тироде и заливают тем же раствором из расчета 10 мл жидкости на 1 г сырой ткани. Сюда прибавляют антиген из расчета 1 мг/мл жидкости, стаканчики помещают в термостат па 10 мин при 37°С.

Через 10 мин жидкость, содержащую МРС-А, отфильтровывают от кусочков легких через марлевый фильтр и подвергают лиофилъной сушке. Полученный сухой порошок экстрагируют 80% спиртом из расчета 5 мл на 1 г сырой ткани. Алкогольный экстракт высушивают путем отгонки спирта в атмосфере азота при понижении давления и температуре 50— 55°С. Полученный материал сохраняют в виде сухой пудры в вакууме при —20°С. Перед опытом необходимое количество порошка растворяют в дистиллированной воде; раствор сохраняют в холодильнике.

Для определения активности стандарта МРС-А пользуются отрезком изолированной подвздошной кишки морской свинки, помещенной в аппарат Шульца — Дейля. Несколько раз испытывают чувствительность кишки к гистамину и ацетилхолину вплоть до установления постоянных сокращений на малые дозы (0,1—0,01 мкг). Затем перфузию переключают на жидкость Тироде (или Кребса), содержащую дипразии (10-7) и атропин (10_6). Убедившись, что на гистамин и ацетилхолии реакция отсутствует, в ванночку вводят известное количество приготовленного стандарта МРС-А. Через 15—60 с начинается сокращение кишки, которое медленно нарастает, достигая максимума ко 2-й минуте; после отмывания кишка также медленно расслабляется. По данным Chakaravarty, препарат МРС-А является достаточно активным, если 10 ЕД его дают сокращение высотой от 40 до 70 мм.

Таким образом, проводят 3—4 испытания MPG. Интервалы между отдельными испытаниями должны быть не менее 4—5 мни.

Выход МРС из легких сенсибилизированных животных при действии антигена можно обнаружить в двух вариантах опытов: 1) при инкубации размельченных тканей легких с антигеном; 2) при перфузии изолированных легких жидкостью Тироде и введении в ток перфузии антигена.

В наших опытах легкие сенсибилизированных свинок извлекали, размельчали до частиц диаметром 1—2 мм, отмывали теплым раствором Тироде и заливали тем же раствором из расчета 10 мл на 1 г легких, добавляли аллерген — 0,5 мл сыворотки или 0,5 мл свежего яичного белка,. разведенного 2 : 5, на 1 г ткани. Взвесь легких помещали в термостат на 10 мин при температуре 37°С. Контрольную пробу (без антигена) также помещали в термостат.

После инкубации антигена с тканью легких жидкую часть взвеси отсасывали в охлажденный сосуд и до начала испытаний сохраняли в холодильнике при температуре 2—4°С.

Для испытания содержания МРС-А пользовались препаратом изолированной подвздошной кишки несенсибилизированной морской свинки. Вначале устанавливали чувствительность препарата к стандарту МРС-А. Затем в ванночку вносили 0,5—1 мл испытуемой жидкости, предварительно нагретой до 37°С. Если испытуемая жидкость содержала МРС-А, препарат кишки начинал медленно сокращаться. Сокращение начиналось па 25—40-й секунде, реакция медленно нарастала, достигала максимума ко-2-й минуте (рис. 39). Расслабление происходило также медленно при повторных отмываниях. Результаты опытов на сенсибилизированных морских свинках приведены в табл. 64. Через 10 мин инкубация ткани легких сенсибилизированных животных с аллергеном в промывной жидкости обнаруживалось от 137 до 281 ЕД MPG-A па 1 г сырой ткани.

При перфузии легких in vitro мы воспользовались методом, предложенным Bhattacharya pi Delaunais (1955). Препарат изолированных легких сенсибилизированных морских свинок перфузировали жидкостью Тироде (2 части) с прибавлением 1 части 5% полиглюкина при температуре жидкости 37° и постоянном насыщении кислородом. Перфузия проходила со скоростью 2—3 мл/мин. Испытуемые вещества и антиген вводили в ток перфузата через канюлю, введенную в легочную артерию, в объеме 0,5— 1 мл. Обычно через 1—l,5 мин после введения антигена возникал выра-женпый бронхоспазм, доходивший в большинстве опытов до полного прекращения дыхательных движений и длившийся от 0,5 до 1,5—2 мин.

С момента введения в легкие антигена начинали сбор оттекающей лер-фузиоииой жидкости в отдельные охлаждаемые стаканчики через интервалы 30 с, 1, 3 и 6 мин после введения в ток перфузии аллергена. Б иерфузате определяли содержание следующих биологически активных веществ: MPG: тест-объект — обработанная дипразином (10-7) подвздошная кишка морской свинки. Гистамии: тест-объект — обработанная атропином (10-6) подвздошная кишка морской свинки. Соротопии: тест-объект — эстрирующая матка девственной крысы (0,5 мл диметилстильбэстролпропионата вводили за сутки внутримышечно).

Ацетилхолип: тест-объект — обработанная эзерином (10-5) прямая кишка живота лягушки или изолированное легкое лягушки. Результаты опытов показали, что количества серотонина, обнаруживаемые в порфузатах легких сенсибилизированных животных после действия аллергена, ничтожны, стоят на грани чувствительности биологических тест-объектов (рис. 40). Это фактически дает нам основание утверждать, что, по-видимому, выделение серотонина не играет существенной роли в механизме аллергического бронхоспазма у морских свинок. Более постоянным и закономерным было появление в перфузате гиста-мина и MPG-A. Наши данные совпадают с имеющимися в литературе сведениями о характере и времени освобождения этих веществ из тканей легких сенсибилизированных животных (Chakravarty, Brocklehurst и др.) Гистамин в количестве от 8 до 24 мкг/мл обнаруживается уже в первой порции перфузата, собранной через полминуты после введения антигена. Количество его быстро нарастает к концу 1—2-й минуты и постепенно уменьшается к 5—6-й минуте. Что касается MPG-A, то через 30 с она в перфузате еще не обнаруживается. К 1-й минуте появляется небольшое ее количество (преимущественно в виде следов или в среднем около 30 ЕД на 1 мл перфузата) (см. выше).

Максимум содержание МРС-А достигало в наших опытах к 5—6-й минуте, составляя в среднем около 180—200 ЕД на 1 мл перфузата. Какое из этих двух веществ более специфично и, следовательно, ответственно за возникновение аллергического бронхоспазма, решить окончательно трудно. Антагонисты гистамина — дипразин, пакатол и др. — не снимали аллергического бронхоспазма, хотя в некоторых опытах спазм был менее выражен. Прямые антагонисты MPG неизвестны, поэтому и вопрос о месте МРС-А в патогенезе бронхиальной астмы остается в известной мере открытым. Для окончательного его решения необходимо, очевидно, выяснить точную химическую природу МРС-А и изыскать (синтезировать) антагонисты ж либераторы ее.

В НИАЛ АМН СССР изучали освобождение МРС-А из тканей легких пассивно сенсибилизированных животных. Антитела для пассивной сенсибилизации получали от активно сенсибилизированных морских свинок. У животных производили тотальное кровопускание из сонных артерий. Сыворотку крови диализировали против физиологического раствора в течение суток со сменой жидкости и далее использовали для пассивной сенсибилизации.

Опыты с пассивной сенсибилизацией проводили в двух вариантах: 1. От 3 до 5 мл сыворотки, содержащей антитела, вводили внутрибрюшинно взрослой морской свинке. Через 20—48 ч ее убивали кровопусканием для приготовления препарата изолированных легких. При введении в ток перфузии препарата легких специфического аллергена возникал броихоспазм. Порции перфузата для определения биологически активных субстанций собирали, как указано выше. 2. Готовили препарат изолированных легких несенсибилизироваш-гах морских свинок по указанной выше методике, Исследовали реактивность препарата на гистамии (КН—10-7). Когда реакция на гистамин проходила и восстанавливались движения легких, в ток перфузии вводили от 3-до 5 мл сыворотки сенсибилизированного животного (пассивная сенсибилизация) . Перфузию приостанавливали на 5—3-й минуте для более полного контакта антител с легкими. Затем перфузию восстанавливали и в ток ее вводили специфический аллерген — лошадиную сыворотку либо разведенный яичный белок.

Через 0,5—1 мин обычно возникал бронхоспазм, как правило, менее-выраженный, чем в случаях активной сенсибилизации.

Результаты опытов представлены в табл. 65 и 66 и свидетельствуют о возникновении бронхоспазма под действием антигена и об освобождении MPG-A из тканей легких в обоих случаях массивной сенсибилизации.

О влиянии ионов калия и кальция на выход МРС-А из легких сенсибилизированных морских свинок

Значение ионов калия и кальция в механизме анафилаксии гладкомы-шечных органов привлекает внимание многих исследователей. Schild (1959) обнаружил, что ионы кальция необходимы для освобождения связанного гистамина из различных органов сенсибилизированных морских свинок при анафилаксии. В то же время возбуждающее действие ацетял-холииа, серотонина и гистамина на матку и тонкую кишку морских свинок значительно уменьшается в растворе, лишенном ионов кальция (Egman, Schild, 1962, и др.).

Возбуждающее действие антигена на гладкие мышцы сенсибилизированного яшвотного, по нашим данным, сохраняется и в среде, без кальция, когда реакция на ацетилхолин и гистамин уменьшалась более чем вдвое, а иногда и исчезала. Вместе с тем помещение петли кишки или рога матки в жидкость Тироде без калия лишало их способности к анафилактической контрактуре, хотя реакция на фармакологические раздражители при этом сохранялась (Л. Д. Адо, Л. М. Ишимова и А. А. Польнер, 1963).

Как показали Jukisada, Ebashi (1961), в бескальциевом растворе, когда реакция на ацетилхолин и гистамин резко ослабевала, совершенно неизмененной сохранялась реакция гладкой мышцы на барий (10—100 мкг на 1 мл). Авторы полагают, что барий непосредственно действует на мышечное волокно, вызывая его сокращение. И. Н. Ковязии (1947) в нашей лаборатории показал, что хлорид бария увеличивает анафилактическую реакцию изолированного тонкого кишечника кролика и способен выявить состояние сенсибилизации этого органа к белковым аллергенам.

Исходя из этих данных, нами было высказано предположение о воз-можности непосредственного возбуждающего действия аллергена на мышечные волокна, минуя промежуточные биологически активные вещества. Анафилактический бронхоспазм препарата изолированных легких, пер-фузируемого жидкостью Тироде, лишенной ионов кальция либо солей калия, по нашим наблюдениям, также возникал, хотя реакция была более слабой, чем в обычном растворе Тироде (А. Д. Адо, В. Н. Абрикосов, 1961).

В приводимых ниже опытах мы решили испытать влияние ионов калия и кальция на процесс освобождения МРС из легких сенсибилизированных животных (табл. 67).

Препараты легких готовили, как указано выше. Вначале для перфузии использовали обычный раствор Тироде, испытывали чувствительность препарата к ацетилхолину или гистанину. Затем перфузию переключали на жидкость Тироде без калия или без кальция и через 10—15 мин после этого вводили аллерген.

В 2 наших опытах из 4 аллергический бронхоспазм был неполным: амплитуда движения легких уменьшалась, но сохранялась, и через 30— 60 с дыхание самостоятельно восстанавливалось (+). В двух других опытах произошло кратковременное (на 10—15 с) прекращение движений легких, затем движения самостоятельно восстанавливались ( + +). Случаев полного прекращения движений легких на 1—2 мин и больше-( + + +) как в контрольных опытах, не было. Наличие МРС-А определялось в 4 порциях перфузата. Через 30 с после введения аллергена в пер-фузате практически МРС-А не обнаружено. Она появилась на 2-й минуте,. но количество ее было в 2 раза меньше, чем в контроле. Следовательно, недостаток ионов кальция несколько угнетает освобождение МРС-А при аллергической реакции, но не снимает его полностью.

В растворе без калия бронхоспазм на введение аллергена возникал. В одном случае он был слабым (±) и выражался в уменьшении амплитуды движений наполовину с последующим быстрым восстановлением функции легких. Кратковременное прекращение движений легких было в одном опыте (++) (см. табл. 67), уменьшение движений — в двух опытах.

Освобождение и выход в перфузат MPG в условиях опыта с раствором-Тироде без калия были несколько слабее, чем в контроле и в жидкости без кальция. Таким образом, недостаток в питательной жидкости ионов. калия или кальция влечет за собой ослабление выхода МРС-А из перфу-зируемой ткани, но не прекращает его (рис. 41).

Хотя механизм освобождения МРС-А из сенсибилизированных тканей при анафилаксии до конца не ясен, полагают, что под влиянием аллергена происходит новообразование МРС-А и затем уже ее освобождение. Известно, что для освобождения гистамипа при анафилаксии обязательно участие ионов кальция (Schild, 1939). Роль ионов кальция, так же как и попов-калия, не является столь необходимой для процесса освобождения МРС-А, так как отсутствие в окружающей ткани среде ионов кальция вызывает-незначительный и, по-видимому, неспецифический эффект, обусловленный дизионией.

Вопрос о механизме освобождения МРС-А при анафилаксии и аллер гии нуждается в дальнейшем изучении.