Вопросы стандартизации и контроля активности аллергенов
Вопрос о стандартизации содержания аллергенов в различных веществах и препаратах находится в настоящее время в центре внимания аллергологов. До сих пор нет единой принятой международной системы стандартизации аллергенов. Основная трудность создания таковой системы заключается в том, что мир аллергенов исключительно широк и разнообразен. Химическая природа и способы действия аллергенов на организм, а также их антигенная активность также очень разнообразны и во многих отношениях недостаточно изучены. Различают содержание того или иного аллергенного материала (белка, пептида, гликопротеида и т. д.) на единицу массы (г, мг) исходного материала и биологическую активность аллергена, выражаемую в кожных дозах или в способности вступить в иммунную реакцию вне организма с антителами или с клетками.
Вопросу о стандартизации аллергенов был посвящен специальный симпозиум Всесоюзной организации здравоохранения в Женеве в
Стандартизация аллергенов имеет много аспектов, среди которых можно* выделить следующие:
выбор аллергенов,
унификация действующих единиц аллергенов,
стандартизация веществ-адъювантов,
методы стандартизации на больном,
методы стандартизации вис организма больного,
вопросы разведений, состава разводящей жидкости, консервантов.
Вопрос о выборе аллергена для создания стандартного реферанс-пре-нарата связан с рядом трудностей. Количество известных видов аллергенов, применяемых в практической аллергологии, исчисляется в настоящее время многими сотнями названий. Химическая природа и структура активного вещества в составе того или иного аллергена для многих видов. аллергепов пока не определена или определепа недостаточно точно (пылевые аллергены, аллерегпы из насекомых, многие пищевые аллергены,. эпиаллергены и др.). Даже для сравнительно изученных пыльцевых аллергенов до настоящего времени нет единого мнения по вопросу о главнейших действующих в аллергене веществах в составе пыльцы того или иного растения. Применительно к бактериальным аллергенам большое значение имеет громадное разнообразие штаммов и их вариантов для; каждого вида микроба, существенно различающихся по их аллергенной и сенсибилизирующей активности. Как показали наши исследования, существенное значение имеет, например, факт наличия или отсутствия у того или иного вида микробов, населяющих бронхо-легочпый аппарат больного бронхиальной астмой, общих антигенных детерминант с тканями легких или бронхов (Л. Д. Адо, В. Н. Федосеева, 1971). Для пыльцевых аллергенов обнаружено наличие общих антигенных свойств у пыльцы луговых трав, общие антигены известны для пыльцы некоторых сорняков, полыни, подсолнечника и др. Общими аллергенными свойствами обладают пищевые аллергены разных видов картофеля, пшениц, ржи и т. д. Эти данные послужили основанием для приготовления многими фирмами, выпускающими аллергены, с диагностическими и лечебными целями микст-аллергенов (букеты, наборы). Они состоят из основных аллергепов. той или иной группы, содержащих общие антигенные детерминанты для разных представителей данной группы, в том числе и для не входящих в состав микстов. Так, например, микст-аллерген пыльцы луговых трав готовят из пыльцы тимофеевки, имеющей общие антигенные детерминанты с пыльцой многих видов трав. Микст-аллерген для пылевых аллергепов. производят из пыли, обладающей наибольшей аллергенной активностью при испытании на больных и имеющей общие антигенные детерминанты с большим количеством пылей различного происхождения. Микст-аллергены изготавливают и выпускают из аллергенов животного происхождения, некоторых групп пищевых аллергенов и т. д. Применение микст-ал-лергепов сокращает число диагностических инъекций больным или число-постановок соответствующих реакций вне организма. Оно служит также хорошим ориентирующим приемом для диагностики чувствительности больных к той или иной группе аллергенов.
Количественный подход к оценке активности того или иного аллергена основывался прежде всего на определении кожной дозы, т. е. того минимального количества аллергена, которое способно вызвать кожную реакцию определенного объема. Определение объема реакции не является до настоящего времени общепринятым и стандартизованным для всех известных аллергенов. Часто объем реакции выражается в плюсах; при этом обозначение от 1 до 4 плюсов соответствует возрастающей интенсивности кожной реакции. Однако способы оценки интенсивности реакции в виде хотя бы площади возникшего воспаления на коже при применении разных аллергенов пока еще различны у разных авторов. Например, для оценки кожных реакций на бактериальную суспензию в количестве 0,1 или 0,02 мл Й. Лишка предлагает следующие обозначения (табл. 19).
Примечание. При дозе 0,02 мл средняя величина реакции снижается втрое.
Серьезной критике подвергается в настоящее время предложенный ранее прием стандартизации аллергенов по весовым количествам вещества (экстрагируемого сырья, например, из пыльцы растений) в аллергене. Единица Нуна выражает количество экстракта, полученного из 10-
Другой прпем стандартизации аллергенов по содержанию в них белка (PNU) 2 или общего количества азотсодержащих соединений (TNU) 2 также подвергается критике. Действительно, белки, содержащиеся в том .или ином аллергенном материале (ткани растений, животных, микробов), часто имеют различную природу и свойства. Наряду с белками, обладающими высокой аллергенной активностью, в аллергенах могут содержаться неактивные баластные белки, влияющие, одпако, на величину PNU. Исследования показывают, что данные кожных проб лучше коррелируют с реакцией освобождения гистамина из тканей с содержанием глобулина Е, чем с PNU исследуемых аллергенов. Поэтому проблема стандартизации аллергенов в настоящее время в большей степени развивается по пути разработки методов иммунохимического их тестирования (РАСТ-тест, либерация гистамина и др.), чем по пути использования более грубых весовых или азотометрических способов их выражения.
С проблемой стандартизации аллергенов теспейшим образом связапа проблема очистки аллергенов от сопутствующих им балластных биологически инертных или даже ипгибирующих их активность веществ.
В Институте Пастера в Париже Guibert (1969) разработал метод стандартизации неинфекционных аллергенов, основанный па иммунологическом принципе. У кроликов получали иммунные сыворотки по отношению к тому или иному виду аллергена. Затем при помощи реакции преципитации в агаре определяли наибольшее разведение аллергена, способное
Рис. 24. Соотношение белковых и углеводных компонентов в некоторых аллергенах (схема) (по Barrens, 1971).
1 семена хлопка; 2 — семена клещевины: 3 — пыльца амброзии, фракция Е; 4 —пыльца амброзии, фракция К; 5 — коровье молоко; 0, 10, 17 — пыльца амброзии; 7—пыльца райграсса; 8 —яичный белок; 9 —ручейник (насекомое); 11—ипекакуана; 12 —перхоть лошади; 13 — томаты; 14 — перхоть человека; 15— домашняя пыль; 16—перья; 18 —сеио; 10 — аскариды; 20 — лакрица; 21—капок (ватоподобиые волокна семян тропического дерева); 22 — трихофи-тои. Косая штриховка — содержание пептидов в процентах, штриховка ромбами — содержание углеводов в процентах.
вызвать образование линий преципитаций с соответствующей антисывороткой. Метод соблазняет своей относительной простотой и кажущейся убедительностью с иммунологических позиций. Его недостатком является то, что данные реакции преципитации в желе обычно не коррелируют с активностью аллергена, определяемой по кожным пробам. Метод может быть использован в качестве одного из дополнительных приемов стандартизации аллергенов.
С проблемой стандартизации аллергенов тесно связан вопрос сравнительного изучения их химического состава и физико-химических свойств. Усилия многих исследователей в связи с этим направлены на выявление сходства и различий в химическом составе и физико-химических свойствах различных аллергенов. Относительно много сделал в этом огношеиии Berrens (1971) для неинфекционных аллергенов (рис. 24). Установлено, что практически все неинфекционные аллергены представляют собой различные комбинации пептидов и Сахаров (гексозы и пентозы). При этом в одних аллергенах преобладают пептидные составные части (пыльца амброзии, луговых трав, семена хлопка, клещевины, лошадиная перхоть и др.) а другие почти полностью состоят из углеводов (аскариды, трихофитон, солодковый корень, некоторые виды домашней пыли и др.).
Есть аллергены примерно с одинаковым содержанием пептидных и углеводных компонентов. Попытки характеризовать неинфекционные аллергены по особенностям их аминокислотного состава не дали положительных результатов. Состав аминокислот не характеризует активность того или иного аллергена. Данные о содержании амипокислот в некоторых аллергенах приводятся в табл. 20.
Определение отношения тирозин/триптофан также не дало ничего существенного для характеристики аллергенных свойств исследуемого материала. Значительное содержание пигментов во многих аллергенах затрудняет спектрофотометрическое исследование. Особое значение приобрело изучение содержания лизина, так как через него осуществляется связь пептидов аллергена с сахарами. Содержание несвязанного лизина (действующего available лизина) имеет значение для реализации процессов потемнения, известных при хранении пищевых продуктов. Эта реакция имеет также место при соединении пептидов с сахарами и, как оказалось (Berrens, 1971), является важной биохимической характеристикой активности аллергенов. Содержание свободного (не связанного с сахарами) лизина примерно соответствует общему содержанию азота в аллергенах (см. табл. 20).
Некоторые сведения о физико-химических свойствах атонических аллергенов уже приводились при описании их отдельных видов. Проблема стандартизации аллергенов выдвигает задачу поиска общего в различном и выявления особенностей каждого аллергена в отдельности. Сравнительное изучение указанных аллергенов показало, что молекулярная масса их колеблется от 5000 до 40 000. Большинство аллергенов имеет изоэлектри-ческую точку в кислой зоне (рН 2,0—5,5) и обладает быстрой электрофо-ретической подвижностью к аноду. Богатые белком аллергены двигаются со скоростью β-глобулинов сыворотки крови человека.
Константа седиментации S20, W у разных аллергенов изменяется в пределах от 1,0 до 4,0. Соли [(NH4)SO4 или NaCl)] осаждают аллерген тем легче, чем меньше содержится в лих углеводов. Обычно концентрация сульфата аммония 0,3—0,8 насыщения достаточна для осаждения аллергена из водного раствора.
Соединение пептида с пентозой (арабипозой) происходит через е-ами-ногруппу лизина и альдегидную группу пептозы с образованием продукта реакции в виде 1-амипо-1-деокси-2-кетозы (пентулозы), дающей полосу поглощения 280—290 им. Реакция подвижна и сопровождается образованием 1,2-эпольной или 2,3-эиедиольпой форм, имеющих соответственно полосы поглощения 305—330 и 320—370 им. Реакция протекает следующим образом:
По мнению Berrens, 1-амино-1-диокси-2 кетоза (схема 6) является важной активной химической группой в аллергенах иеипфекционной природы и в какой-то степени выражает химическую структуру аптиген-ных детерминант атопичоских аллергенов.
Аллергены термостабильны. При пагревании до 100°С многие виды аллергенов не разрушаются. Термостабильностъ связана с наличием аллергенных прочных лизипо-сахарных соединений, обусловливающих гид-рофильпость, а в сухом виде гигроскопичность материала.
позволяет определить среднее количество блокированных сахаром аминогрупп лизина в молекуле аллергена. Хромофорная группа, определяющая поглощение ультрафиолетового излучения в зоне 305 и 325 им, возникает в месте соединения с сахаром. Эта хромофорная группа, по Berrens, представлена в следующем виде:
действию протеолитических ферментов — трипсина и пепсина. В табл. 21 представлены физико-химические свойства некоторых важных в практическом отношении аллергенов.
Подводя итоги наших знаний о возможности стандартизации активности аллергенов, следует указать, что пока наиболее достоверные данные можно получить с помощью кожных и провокационных проб.
Среди иммунологических приемов оценки активности аллергенов вне организма заслуживают внимание реакция преципитации в желе, реакции на изолированных гладкомышечпых органах, опыты с воспроизведением анафилаксии и десенсибилизации, реакции базофилов и тучных клеток и др. Среди химических методов исследования несомненный интерес представляют спектрофотометрические и флюоресцентные методы исследования пептидно-углеводных комплексов (И. И. Рыжкова, 1975; Berrens, 1971).
