Стандартизация экстрактов аллергенов

Необходимость стандартизации аллергенных экстрактов не вызывает сомнений. Непостоянство состава и концентрации аллергена в экстрактах представляет основную проблему как при аллергологической диагностике, так и для проведения специфической иммунотерапии. Без стандартизации экстрактов невозможно осуществлять и контроль специфической гипосенсибилизации. В связи со значительным различием аллергенной активности экстрактов в каждом из флаконов аллергена врачи часто вынуждены изменять схему проведения иммунотерапии при переходе на новый флакон. При этом каждый пользователь проводит свои исследования активности экстракта, редко сравнивая концентрацию специфического аллергена с аналогичным препаратом другой серии. В результате клиницисты при проведении специфической иммунотерапии аллергенами применяют скорее интуитивный, а не научный подход. Но и в этой области происходят положительные изменения. Появление высокоочищенных или даже клонированных аллергенов, экспрессированных в бактериальных или дрожжевых клетках, позволяет получать неограниченные количества аллергенных экстрактов, практически не отличающихся от маточных растворов [2126].

Количественная оценка аллергенов

Многокомпонентность биологического материала и чрезвычайно высокая чувствительность IgE-опосредованных реакций иммунной системы, реагирующих на нанограммовые количества Аг, значительно затрудняют стандартизацию аэроаллергенов. Традиционно в качестве метода выделения и стандартизации препаратов аллергенов для клинического применения использовали экстракцию навески обезжиренной пыльцы в определённом объёме жидкости: например, 1 г в 100 мл жидкости представляет собой 1% (1:100) раствор, концентрируемый или разводимый при необходимости. Одна из широко распространённых систем стандартизации предполагает, что в 1 мл раствора аллергена, разведённого 1:1 ООО ООО, содержится одна пыльцевая единица (единица Нуна, Noon Unit) или одна пыльцевая единица Нуна содержит 0,001 мг экстрагированной пыльцы. В качестве другой системы оценки количества аллергенов, широко используемой производителями аллергенов во многих странах, в том числе и в России, используют единицу белкового азота Protein Nitrogen Unit (PNU). В основе стандартизации по системе PNU лежит положение о том, что большинство аллергенных молекул пыльцы имеют белковую природу, а доля белка в общей массе аллергена у разных растений различается. По этой методике азот выделяют с помощью фосфорновольфрамовой кислоты, а затем измеряют его количество по микрометоду Кьельдаля. Измерение общего азота при стандартизации аллергенов практически не применяют. Оба методических подхода используют при стандартизации не только пыльцевых, но и других ингаляционных и пищевых аллергенов, и врачи должны ориентироваться в этих стандартах. Однако ни один из этих методов не отражает аллергенной активности, так как далеко не все экстрагированные белки обладают аллергенными свойствами. Кроме того, многие комплексные аллергены разрушаются при проведении жёсткой процедуры выделения. Эти проблемы возникают при проведении биологических исследований функциональной активности аллергенов. Пыльца амброзии и злаковых трав, а также аллергены клещей домашней пыли и кошки стандартизованы, а их активность выражена в единицах аллергенной активности (Allergen Units, AU) или биологических аллергенных единицах (Biological Allergenic Units, BAU). Список стандартизованных таким образом аллергенов постоянно пополняется.

Характеристика аллергенов

Для характеристики аллергенов применяют различные подходы. Большинство из них, в том числе определение содержания белка, молекулярной массы и изоэлектрическое фокусирование, не относится к уникальным методам исследования аллергенных веществ, а представляет собой известные методы характеристики белков. При исследовании молекул, ответственных за IgE-опосредо-ванные симптомы, применяют различные категории тестов. Наряду с такими иммунологическими методами, как PACT и вестерн-блоттинг, широко используют биологические методы in vivo (например, конечная точка разведения при кожном тестировании).

Радиоаллергосорбентный тест

Радиоаллергосорбентный тест (PACT), предназначенный изначально для выявления аллергенспецифических IgE-AT, может быть использован и для определения концентрации аллергена. Для этого исследуемый аллерген фиксируют на нерастворимом носителе (целлюлозном диске или бусах), к которому добавляют известное количество аллергенспецифических IgE-AT в стандартной тест-системе. После этого сопоставляют результаты, полученные при исследовании экстракта, с тщательно подобранным стандартным референс-препаратом [27]. По определению, чем больше IgE связывается с Аг, тем выше его аллергенность.

Метод подавления PACT

При исследовании аллергенной активности широко используют метод инги-биции PACT вариант прямого PACT. Содержащую IgE-AT сыворотку больного аллергическим заболеванием смешивают с раствором исследуемого аллергена, после чего добавляют к смеси известное количество аллергена, иммобилизованного на носителе. Чем выше аллергенность экстракта, тем меньше остаётся свободного IgE, количество которого определяют по связыванию с иммобилизованным носителем [28]. Метод и статистическая обработка его результатов к настоящему времени стандартизованы. Метод ингибиции PACT используют как основную технику при оценке общей аллергенной активности экстрактов, а также при производстве аллергенов для калибровки новых образцов путём сопоставления с внутренними стандартными препаратами. Впрочем, в последнее время некоторыми исследователями целесообразность дальнейшего использования ингибиции PACT по стандартной методике ставится под сомнение [29]. Связано это с тем, что способность аллергена взаимодействовать с фиксированным на носителе аллергеном может изменяться, оказывая таким образом влияние на результаты теста. Кроме того, имеет определённые ограничения и использование аллергенной референс-сыворотки: сравнение невозможно без идентичных рефе-ренс-сывороток и иммобилизованных аллергенов.

Оценка аллергенности

Биохимические методы характеристики аллергенов, касающиеся состава и концентрации белков, практичны, но фактически ничего не говорят об аллергенных свойствах экстракта. Препараты аэроаллергенов содержат большое количество Аг, из которых один или несколько доминирует по способности вызывать кожные реакции у сенсибилизированных больных. Из этого следует, что именно эти Аг представляют значимость и с клинической точки зрения. Однако не все больные, сенсибилизированные к определённым аллергенам, реагируют на тот же аллерген из экстракта. Аг деревьев, злаковых и сорных трав иммунологически различны, и это совпадает с клиническими данными и результатами кожных тестов. Поскольку выделено и очищено большое количество аллергенов, это позволяет надеяться, что корреляция между иммуногенностью и биохимическим составом будет скоро установлена. Существует предложение определять как главный (основной) аллерген тот, который вызывает положительный результат при кожном тестировании в концентрации менее 0,001 мкг/мл у 90% больных аллергическими заболеваниями [9]. В настоящее время распространение получил подход, согласно которому как главный аллерген расценивают тот, который при радиоиммуноэлектрофорезе связывается с IgE более чем в 50% сывороток сенсибилизированных больных [30]. К малым аллергенам относят все остальные, не соответствующие вышеупомянутым критериям.

Природные аллергены, вызывающие развитие атопических заболеваний, по физико-химическим характеристикам незначительно отличаются от других Аг. Все они представляют собой белки или гликопротеины, хотя в составе Candida albicans обнаружены и высокомолекулярные полисахариды, связывающиеся с IgE. Большинство белков, входящих в состав аллергенов, относятся к кислым, их мол. масса в пределах 560 кД. Постулируется, что большие молекулы аллергенов не могут проникать через слизистую оболочку. Среди аллергенов амброзии и трав выявлены также высокореактивные аллергены с небольшой молекулярной массой. Антигенные детерминанты, реагирующие с молекулой IgE, для большинства аллергенов точно не идентифицированы, хотя предполагается, что их должно быть не, менее двух на каждую молекулу. Если для главного аллергена трески Gad с 1 (Аг М) более важна аминокислотная последовательность, чем конформация молекулы [31], то для аллергенов амброзии Amb а 3 (Ra 3) и Amb а 5 (Ra 5) именно конформация молекулы нативного аллергена определяет её аллергенность [32].